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PhytoChemia Acta

Vulgarisation

100% identifié?

26 janvier 2019

Vulgarisation – Alexis St-Gelais, M. Sc., chimiste

Les rapports d’analyse pour les profils d’huiles essentielles rapportent le plus souvent un total des composés identifiés. Dans nos rapports, tout comme dans la littérature scientifique, ce total n’atteint presque jamais 100%. Toutefois, plusieurs autres laboratoires d’essai rapportent régulièrement avoir identifié 100% de l’huile essentielle en routine. Comment cela est-il possible?

La réponse se trouve dans une poignée de choix éditoriaux faits par les laboratoires. Ceux-ci se rapportent à trois éléments: la manière dont le total est calculé; la façon dont le chromatogramme est intégré; et les paramètres d’injection de l’huile. Mais débutons par quelques illustrations, car elles sont bien plus parlantes qu’une longue discussion.

Voici une portion du chromatogramme d’une huile essentielle d’orange.

Intégrer un pic signifie le « sélectionner » afin qu’il soit considéré dans le cadre de l’analyse. Dans le logiciel que nous utilisons à cette fin (Unichrom), les pics intégrés apparaissent en vert, et le sommet du pic est relié à l’axe du temps en bas de l’image par un petit trait. Ainsi, chaque trait que vous voyez indique qu’un pic a été intégré. En regardant le chromatogramme cis-dessus, on peut constater que j’ai été assez exhaustif dans mon intégration. Voyez comme j’ai même intégré de très petits pics, à peine visibles. J’ai ici un total de 14 pics, et j’ai confiance que nous pourrions tous les identifier. Et voilà, 100% d’identification!

Mais que se passe-t-il si on zoome un peu?

Diantre! Plus de pics apparaissent. Je les ai donc sélectionnés également – après tout, ils font partie de l’échantillon. Je compte désormais 29 pics. Peut-être qu’il me serait encore possible de tous les identifier, cela dit. Le score de 100% d’identification reste à portée.

Mais on pourrait encore s’approcher…

Aïe, voilà qu’il y a encore plus de pics… J’en vois pas moins de 65 sur cette image! Et nous pourrions encore zoomer davantage, bien que vous pouvez peut-être voir que nous nous approchons du bruit de fond du signal – c’est-à-dire l’endroit où les choses deviennent floues car le signal produit par l’instrument n’est pas parfaitement plat (malgré ce qu’on aurait pu penser à voir les premiers chromatogrammes). Voici un dernier zoom pour montrer le processus, avec cette fois environ 88 pics:

Si je n’étais pas limité par la puissance de mon détecteur, il semble que cette tendance n’aurait pas de fin. En traçant le graphique des données observées ci-dessus (nombre de pics en fonction du degré de « zoom »), on obtient la tendance suivante:

Vous pouvez voir une sorte de forme de S dans cette tendance. Au plus petit nombre de pics, si on réduisait encore plus le zoom, on ne se concentrerait que sur la poignée de pics principaux de l’huile essentielle. Il serait difficile d’en voir moins sans perdre en chemin l’essence même du processus d’analyse. À l’inverse, si on zoomait encore plus, on atteindrait un plateau dans le nombre de pics, puisque les plus petits se perdent progressivement dans le bruit de fond du détecteur.

Dans les exemples précédents, le zoom peut être vu comme une métaphore des paramètres d’intégration. Concrètement, quand ils s’attardent à un chromatogramme, les analystes vont employer une série d’outils de leurs logiciels d’interprétation pour automatiquement intégrer les pics. Pour ce faire, ils vont fixer un certain nombre de paramètres pour guider l’algorithme lors du processus de sélection. En ajustant ces paramètres, vous pouvez choisir d’intégrer plus ou moins de pics. Chez PhytoChemia, nous ajoutons ensuite une étape d’intervention manuelle pour corriger les aberrations dans le processus d’intégration automatique, le tout à un niveau de « zoom » préétabli. Les laboratoires vont habituellement décider d’un seuil sous lequel les pics seront tout simplement ignorés. Si ce seuil est assez élevé, il y a des chances pour que tous les pics intégrés soient identifiés. On peut alors atteindre les 100% d’identification, puisque les pics minuscules et non-identifiés sont tout bonnement ignorés. Voici comment les paramètres d’intégration peuvent affecter le total d’identification.

En outre, de manière générale, plus vous tentez d’identifier un grand nombre de pics, plus la valeur ajoutée du pic additionnel au total devient « insignifiante ». Prenons le même chromatogramme d’huile d’orange que ci-dessus. J’ai préparé un graphique illustrant cette tendance. En conservant seulement les 65 pics les plus notables, je fixe la somme de ces 65 pics comme étant 100% du signal. Ensuite, je calcule la contribution du plus grand pic (le limonène) sur le total identifié: 95.5% du signal de l’ensemble des 65 pics est attribuable au seul limonène. C’est assez normal pour une huile d’orange. Le second plus grand pic amène le total d’identification à 97.4%, et ainsi de suite jusqu’au 65e pic qui nous mène à 100%.

Très rapidement, les pics additionnels ne contribuent que marginalement au total. Le seuil des 99% identifiés est atteint après 7 pics, le 13e pic nous mène à 99.5% et il faut monter à 38 pics pour franchir la barre des 99.9% (gardez en tête qu’il s’agit ici d’une portion de l’huile d’orange; j’ai ignoré une partie du chromatogramme par souci de simplicité, et les chiffres n’ont pas de représentativité pour une huile d’orange complète). Pour véritablement atteindre 100%, je dois identifier les 65 pics. C’est difficile à faire, puisqu’à partir d’un certain point nous devons gérer des signaux très faibles. Supposons qu’il soit possible d’identifier 25 pics. Si j’avais défini mon 100% comme étant la somme des 25 plus grands pics, j’aurais pu atteindre ce seuil. Mais comme chez PhytoChemia nous « surintégrons » par rapport à ce que nous pouvons effectivement identifié, nous laissons toujours en place une série de pics faibles et non identifiés. Nous aurions donc obtenu un total identifié de 99.77%. C’est de cette façon que la manière dont vous calculez le total identifié entre en jeu: modifiez votre référentiel, et les nombres changent. Jusqu’à un certain point, c’est une question de goût pour l’analyste.

Enfin, si j’utilisais un instrument de GC-FID d’une génération antiérieure, avec des paramètres d’injection identiques, le bruit de fond du détecteur serait plus important et les plus petits pics disparaîtraient. Si, avec un instrument moderne, j’injectais un plus petit volume d’huile sur la colonne, les pics mineurs se « fondraient » également dans le bruit de fond. L’inverse est également possible: injecter davantage d’échantillon sur un instrument plus sensible augmenterait le nombre de pics qu’il me serait théoriquement possible d’intégrer si je le souhaitais (en quelque sorte, cela donnerait plus de hauteur à la courbe en forme de S montrée plus tôt). Voilà comment la façon dont l’huile est injectée influence le total identifié.

Nous avons décidé, chez PhytoChemia, d’être relativement ambitieux dans le nombre de pics intégrés. De fait, nos rapports présentent des listes de composés relativement longues, particulièrement depuis le début de 2018. Cela signifie également que nous intégrons beaucoup de pics que nous ne pouvons identifier, et explique ce pourquoi nous n’atteignons jamais les 100% d’identification. L’huile d’orange est du reste l’un des cas les plus simples, et nous intégrons régulièrement plus de 250 pics dans des huiles essentielles, dont bon nombre sont inconnus. Notre opinion est que ces petits pics non-assignés font tout de même partie de l’échantillon, et que bien qu’ils échappent à l’identification en analyse de routine, ils ne devraient pas être omis à la faveur d’un possiblement trompeur « 100% » d’identification. D’autres laboratoires adoptent une approche différente. Quelle technique vous semble préférable?

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